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六常见精神障碍的分子遗传学研究进展（第12页）

遗传交互作用是指在特殊环境下，蛋白或者其编码基因受到其他蛋白或者基因的影响，常常表现为表型变化之间的关系。

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五、精神疾病相关基因的功能研究

精神疾病具有一定的遗传度，而且关于精神疾病的遗传研究也发现了很多相关基因，但是目前关于精神疾病发病机制的研究尚未取得一致的定论，因此对于精神疾病相关基因的功能研究便显得十分迫切。

目前，对于已知基因的功能研究方法很多，也取得了非常大的进展，其中最主要的成果集中在精神疾病的转基因动物模型上，这得益于一些传统的和新兴的转基因技术（transgenictechnology），如基因修饰（包括基因敲除和基因导入）、光遗传学方法（optogenetics）和声遗传学方法（sonogenetics）等。

目前，转基因动物模型已广泛应用于疾病发病机制的研究、检测新的治疗方案、药效评价及药物筛选等方面。

（一）基因修饰

基因修饰主要是指通过基因打靶技术，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达（即基因导入，geneknockin），或者把目的基因特定序列从基因组中删除，进而导致该基因功能丧失作用或部分功能被屏障（即基因敲除，geneknockout），通过研究基因打靶后目的基因引起相应生物学效应的内在生物学机制，进而获取该目的基因在疾病发病机制中的生物学功能，作为可能靶点的药物开发价值及潜在的临床应用前景。

基因修饰目前已经广泛应用于精神疾病的发病机制研究和药物开发领域。

其中，以基因敲除方法应用较多，本文也将主要集中在基因敲除方面进行基因修饰的阐述。

基因敲除的方法有很多，根据发展历程可以分为传统的方法（包括全基因敲除、条件性基因敲除和诱导性基因敲除等）和新兴的方法（锌指核酸酶打靶、TALEN切割和CRISPRCas9等）。

1.传统的基因敲除方法

（1）全基因敲除（conventionalknockout）

全基因敲除是用一段外源DNA序列（通常是用于药物筛选的抗性基因，如新霉素Neomycin）将目标基因取代，从而达到使内源性目的基因失活的目的。

该方法的打靶质粒构建相对简单，一般包括一个阳性筛选基因如新霉素抗性基因（neomycinresistancegene，NeoR）和一个阴性筛选基因如单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-tk）、白喉毒素A链（diphtheriatoxinA，DTA）。

在阳性筛选条件下（如G418），只有重组了打靶载体的胚胎干细胞才能成功成活发育；如果发生了同源重组，阴性筛选基因丢失导致不能表达；如果发生了随机插入，HSV-TK会造成DNA复制停止，而DTA可以直接杀死细胞。

由于全基因敲除会将模型生物的所有器官组织和细胞中的目的基因敲除，通常会带来比较明显的生物学效应，严重的导致不育甚至死亡。

因此在特定时期或特定组织器官将目的基因敲除的条件性敲除研究逐步发展起来。

（2）条件性基因敲除（conditionalknockout）

条件性基因敲除是指将某个基因在特定的时期、特定的组织和器官中敲除，主要是通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP和FLP-frt来实现的。

首先在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个LoxP（或Frt）序列，然后将得到的小鼠与带有细胞特异性表达的Cre（或Flp）的小鼠交配，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

通过该方法使模型小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态，主要用于研究在发育的某一阶段或某一特定的组织器官中将目的基因敲除后引起的生物学效应及内在机制，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

（3）诱导性基因敲除

诱导性基因敲除，即在一定的诱导条件下，激活特定基因的转录因子从而启动或阻断目的基因的表达。

其中最常用的一种方法需要将两套受特异性启动子调控的表达载体转入小鼠体内，即受特异性启动子调控的tTArtTA的表达载体和受Ptet启动子调控的Cre重组酶的表达载体。

实际上，该方法由两个互补系统协调发挥作用，分别为Tet-Off（tTA依赖）系统和Tet-On（rtTA依赖）系统。

在四环素或者其衍生物多西环素（强力霉素）存在的情况下，转录因子rtTA与启动子Ptet的相互结合，而在没有四环素的情况下转录因子tTA与启动子Ptet的结合，从而调节下游基因的表达。

因此这两个互补系统是以四环素或多西环素作为Tet-On和Tet-Off系统的效应剂，主动控制特定基因在特定时期特定组织器官中的表达，实现对靶位点的剔除或修饰进行时间和空间二维调控。

另外一种诱导性基因敲除采用LightOn系统，该系统由一种光调控的转录因子和含有目的基因的转录单元构成。

转录因子在蓝光的照射下迅速被激活，从而启动目的基因的转录与表达。

Wang等利用该系统实现了红色荧光蛋白在小鼠肝脏和肾脏的指定区域的光控表达，而且还成功地将患有Ⅰ型糖尿病小鼠的血糖降到较低水平。

由于该技术采用光源作为调控基因表达的诱导条件，因此除了能够在时间和空间上精确可逆地控制目标基因的表达，而且无污染无残留，因此在生物工程产品生产方面也将具有广阔的应用前景。

2.新兴的基因敲除方法

（1）锌指核酸酶（zincfingernuclease，ZFN）打靶技术

ZFN又名锌指蛋白核酸酶，是一种人工改造的核酸内切酶，源自转录调控因子家族，在真核生物中从酵母到人类广泛存在。

该酶由一个特异性的DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂，启动细胞自身的修复系统；然后“同源重组”

将以导入的相似序列作为模板修复该基因区域，实现指定部位的碱基替换。

（2）转录激活样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN）

切割TALEN是基因组编辑核酸酶三大类之一。

该技术借助于TAL效应子（TALeffectors（TALEs），一种由植物细菌分泌的天然蛋白）来识别特异性DNA碱基对，附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，即构建出实现特定位点基因修饰的TALEN方法。